Calculatrice de Ligature

Catégorie : Biologie

- April 02, 2025

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ADN Vecteur

Longueur du Vecteur (pb) :

Concentration du Vecteur (ng/μL) :

Volume du Vecteur dans la Réaction (μL) :

ADN Insert

Longueur de l'Insert (pb) :

Concentration de l'Insert (ng/μL) :

Ratio Molaire Vecteur:Insert :

Volume Total de la Réaction (μL) :

Configuration de la Réaction de Ligation

Quantité Recommandée d'Insert

8.3 ng

0.33 μL de stock d'insert

Quantité de Vecteur

50 ng

Utilisation de 1 μL de stock de vecteur

Ratio Insert:Vecteur

3:1 (molaire)

Optimal pour le clonage standard

Configuration Complète de la Réaction

Composant	Volume (μL)	Quantité Finale
ADN Vecteur (50 ng/μL)	1.0	50 ng
ADN Insert (25 ng/μL)	0.33	8.3 ng
Tampon 10× T4 DNA Ligase	2.0	1×
Ligase ADN T4	1.0	400 U
Eau sans Nucléase	15.67	Jusqu'à 20 μL
Volume Total	20.0

Conseils d'Optimisation

En fonction de vos paramètres d'entrée, voici quelques recommandations :

Pour des extrémités cohésives 5' avec un ratio vecteur:insert de 1:3, incubez à 16°C pendant 4 heures.
Le traitement CIP du vecteur aidera à réduire le fond d'auto-ligation.
Si l'efficacité de transformation est faible, essayez d'augmenter le ratio insert:vecteur à 5:1.
Pour les ligations à extrémités franches, augmentez la concentration de ligase et prolongez le temps de ligation.
Inactivez la ligase par chauffage à 65°C pendant 10 minutes avant la transformation pour de meilleurs résultats.

À Propos de la Ligation ADN

La ligation ADN implique la jonction de fragments d'ADN par la formation de liaisons phosphodiester.
La ligase ADN T4 nécessite de l'ATP et du Mg²⁺ pour fonctionner correctement (fournis dans le tampon de ligation).
Les ligations à extrémités cohésives sont plus efficaces que celles à extrémités franches.
Les ratios molaires vecteur:insert varient généralement de 1:3 à 1:5 pour le clonage standard.
Des ratios insert:vecteur plus élevés (3:1 à 10:1) sont recommandés pour les ligations à extrémités franches ou les inserts plus grands.
La déphosphorylation des vecteurs (à l'aide de CIP, SAP, etc.) empêche l'auto-ligation des vecteurs.
Les systèmes de ligase rapide peuvent réduire le temps de ligation à 5-15 minutes à température ambiante.

Formule pour le montant à insérer (ng) :

\[ \text{Insérer ng} = \left( \frac{\text{Vector ng} \times \text{Taille de l'insertion en kb}}{\text{Taille du vecteur en kb}} \right) \times \left( \frac{\text{Moles d'insertion}}{\text{Moles de vecteur}} \right) \]

Qu'est-ce que le Calculateur de Ligation ?

Le Calculateur de Ligation est un outil qui aide les chercheurs à déterminer la quantité appropriée de vecteur et d'ADN d'insertion requise pour une réaction de ligation réussie. La ligation de l'ADN est une étape critique dans le clonage moléculaire, où un insert d'ADN est joint à un vecteur plasmidique à l'aide d'une enzyme appelée ligase de l'ADN.

Comment ça fonctionne ?

Ce calculateur permet aux utilisateurs d'entrer des détails sur leur vecteur et leur insertion, y compris la longueur et la concentration. En fonction du rapport molaire choisi, il calcule la quantité requise d'ADN d'insertion pour obtenir une réaction de ligation optimale.

Caractéristiques Clés

Calcule les rapports molaires vecteur-insertion pour différents scénarios de clonage.
Prend en charge à la fois les rapports molaires standard et personnalisés.
Fournit des recommandations pour les conditions de ligation en fonction du clonage à bouts collants ou à bouts francs.
Inclut des conseils d'optimisation pour améliorer l'efficacité de la ligation.

Comment utiliser le Calculateur

Entrez la longueur du vecteur (pb) et la concentration (ng/μL).
Entrez la longueur de l'insertion (pb) et la concentration (ng/μL).
Sélectionnez le rapport molaire vecteur-insertion souhaité (par exemple, 1:3, 1:5).
Spécifiez le volume total de la réaction (par exemple, 20 μL).
Pour les paramètres avancés, choisissez la température de ligation, la durée, le type de ligase et les options de traitement du vecteur.
Cliquez sur « Calculer » pour générer la quantité d'insertion recommandée et la configuration de la réaction.

Questions Fréquemment Posées

Quel est le rapport molaire optimal vecteur-insertion ?

Pour les ligations à bouts collants, un rapport vecteur-insertion de 1:3 ou 1:5 est généralement recommandé. Pour les ligations à bouts francs, un rapport plus élevé (par exemple, de 1:5 à 1:10) peut améliorer l'efficacité.

Pourquoi la déphosphorylation du vecteur est-elle recommandée ?

La déphosphorylation (en utilisant CIP, SAP ou phosphatase antarctique) empêche l'auto-ligation du vecteur, réduisant ainsi les colonies de fond indésirables.

Quelles conditions de ligation devrais-je utiliser ?

16°C pendant 4 heures – Condition standard pour la ligase de l'ADN T4.
Température ambiante pendant 15 minutes – Convient pour la ligase rapide.
Une nuit à 16°C – Recommandé pour des ligations difficiles ou le clonage à bouts francs.

Comment puis-je améliorer l'efficacité de la ligation ?

Assurez-vous d'avoir le bon rapport molaire pour le vecteur et l'insertion.
Utilisez une ligase d'ADN et un tampon frais.
Optimisez les conditions de ligation (température et durée).
Confirmez la présence de l'insertion par électrophorèse sur gel avant la ligation.

Pourquoi utiliser ce calculateur ?

Ce Calculateur de Ligation simplifie la configuration des réactions de ligation de l'ADN, aidant les chercheurs à déterminer les bonnes quantités de vecteur et d'insertion pour un clonage efficace. En automatisant les calculs et en offrant des conseils d'optimisation, il fait gagner du temps et augmente le taux de réussite des expériences de ligation.