Calculatrice de Ligature

Catégorie : Biologie
- 04 avril 2025
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ADN Vecteur

ADN Inséré

Mise en Place de la Réaction de Ligation

Montant Recommandé de l'Insert
8.3 ng
0.33 μL de stock d'insert
Montant du Vecteur
50 ng
Utilisation de 1 μL de stock de vecteur
Rapport Insert:Vecteur
3:1 (molaire)
Optimal pour le clonage standard

Mise en Place Complète de la Réaction

Composant Volume (μL) Montant Final
ADN Vecteur (50 ng/μL) 1.0 50 ng
ADN Inséré (25 ng/μL) 0.33 8.3 ng
Tampon de Ligase ADN T4 10× 2.0 1×
Ligase ADN T4 1.0 400 U
Eau sans Nuclease 15.67 À 20 μL
Volume Total 20.0

Conseils d'Optimisation

En fonction de vos paramètres d'entrée, voici quelques recommandations :

  • Pour des fins collantes 5' avec un rapport vecteur:insert de 1:3, incuber à 16°C pendant 4 heures.
  • Le traitement CIP du vecteur aidera à réduire le fond de auto-ligation.
  • Si l'efficacité de transformation est faible, essayez d'augmenter le rapport insert:vecteur à 5:1.
  • Pour les ligations à fins franches, augmentez la concentration de ligase et prolongez le temps de ligation.
  • Inactiver la ligase par chaleur à 65°C pendant 10 minutes avant la transformation pour de meilleurs résultats.

À Propos de la Ligation de l'ADN

  • La ligation de l'ADN implique la jonction de fragments d'ADN par la formation de liaisons phosphodiester.
  • La ligase ADN T4 nécessite de l'ATP et du Mg²⁺ pour fonctionner correctement (fourni dans le tampon de ligation).
  • Les ligations à fins collantes sont plus efficaces que les ligations à fins franches.
  • Les rapports molaire vecteur:insert varient généralement de 1:3 à 1:5 pour le clonage standard.
  • Des rapports insert:vecteur plus élevés (3:1 à 10:1) sont recommandés pour les ligations à fins franches ou les inserts plus grands.
  • La déphosphorylation des vecteurs (utilisant CIP, SAP, etc.) empêche l'auto-ligation du vecteur.
  • Les systèmes de ligase rapide peuvent réduire le temps de ligation à 5-15 minutes à température ambiante.

Formule pour le montant à insérer (ng) :

\[ \text{Insérer ng} = \left( \frac{\text{Vector ng} \times \text{Taille de l'insertion en kb}}{\text{Taille du vecteur en kb}} \right) \times \left( \frac{\text{Moles d'insertion}}{\text{Moles de vecteur}} \right) \]

Qu'est-ce que le Calculateur de Ligation ?

Le Calculateur de Ligation est un outil qui aide les chercheurs à déterminer la quantité appropriée de vecteur et d'ADN d'insertion requise pour une réaction de ligation réussie. La ligation de l'ADN est une étape critique dans le clonage moléculaire, où un insert d'ADN est joint à un vecteur plasmidique à l'aide d'une enzyme appelée ligase de l'ADN.

Comment ça fonctionne ?

Ce calculateur permet aux utilisateurs d'entrer des détails sur leur vecteur et leur insertion, y compris la longueur et la concentration. En fonction du rapport molaire choisi, il calcule la quantité requise d'ADN d'insertion pour obtenir une réaction de ligation optimale.

Caractéristiques Clés

  • Calcule les rapports molaires vecteur-insertion pour différents scénarios de clonage.
  • Prend en charge à la fois les rapports molaires standard et personnalisés.
  • Fournit des recommandations pour les conditions de ligation en fonction du clonage à bouts collants ou à bouts francs.
  • Inclut des conseils d'optimisation pour améliorer l'efficacité de la ligation.

Comment utiliser le Calculateur

  1. Entrez la longueur du vecteur (pb) et la concentration (ng/μL).
  2. Entrez la longueur de l'insertion (pb) et la concentration (ng/μL).
  3. Sélectionnez le rapport molaire vecteur-insertion souhaité (par exemple, 1:3, 1:5).
  4. Spécifiez le volume total de la réaction (par exemple, 20 μL).
  5. Pour les paramètres avancés, choisissez la température de ligation, la durée, le type de ligase et les options de traitement du vecteur.
  6. Cliquez sur « Calculer » pour générer la quantité d'insertion recommandée et la configuration de la réaction.

Questions Fréquemment Posées

Quel est le rapport molaire optimal vecteur-insertion ?

Pour les ligations à bouts collants, un rapport vecteur-insertion de 1:3 ou 1:5 est généralement recommandé. Pour les ligations à bouts francs, un rapport plus élevé (par exemple, de 1:5 à 1:10) peut améliorer l'efficacité.

Pourquoi la déphosphorylation du vecteur est-elle recommandée ?

La déphosphorylation (en utilisant CIP, SAP ou phosphatase antarctique) empêche l'auto-ligation du vecteur, réduisant ainsi les colonies de fond indésirables.

Quelles conditions de ligation devrais-je utiliser ?

  • 16°C pendant 4 heures – Condition standard pour la ligase de l'ADN T4.
  • Température ambiante pendant 15 minutes – Convient pour la ligase rapide.
  • Une nuit à 16°C – Recommandé pour des ligations difficiles ou le clonage à bouts francs.

Comment puis-je améliorer l'efficacité de la ligation ?

  • Assurez-vous d'avoir le bon rapport molaire pour le vecteur et l'insertion.
  • Utilisez une ligase d'ADN et un tampon frais.
  • Optimisez les conditions de ligation (température et durée).
  • Confirmez la présence de l'insertion par électrophorèse sur gel avant la ligation.

Pourquoi utiliser ce calculateur ?

Ce Calculateur de Ligation simplifie la configuration des réactions de ligation de l'ADN, aidant les chercheurs à déterminer les bonnes quantités de vecteur et d'insertion pour un clonage efficace. En automatisant les calculs et en offrant des conseils d'optimisation, il fait gagner du temps et augmente le taux de réussite des expériences de ligation.